“En ausencia de vacuna y de un tratamiento eficaz, la detección precoz de los casos, el rastreo y el aislamiento de los positivos es, sin duda, la mejor estrategia posible”, dice a DM Federico García, jefe del Servicio de Microbiología del Hospital Clínico San Cecilio, de Granada. Pero para eso hacen falta test, miles de test, mucho tiempo de análisis de laboratorio y mucho dinero, pues cada uno cuesta entre 18 y 40 euros, según el modelo. Estados Unidos, por ejemplo, ha realizado ya unos 30 millones de pruebas, cubriendo un poco menos del 10% de su población. Sin embargo, algunos expertos han pedido que se analice a toda la población cada tres meses o incluso cada dos semanas.
¿Hay alguna forma de agilizar y abaratar estas pruebas? ¿Algún atajo para ahorrar tiempo y dinero? La solución se le ocurrió ya en 1943 a Robert Dorfman, un economista estadounidense que la aplicó, en plena Segunda Guerra Mundial, a los reclutas del Ejército para el diagnóstico de la sífilis y publicó los resultados en The Annals of Mathematical Statistics. La estrategia de las pruebas agrupadas se ha utilizado desde entonces en infecciones de transmisión sexual, en el paludismo y frente a otros virus. “Por ejemplo -apunta Federico García-, los Centros Regionales de Transfusión Sanguínea la emplean para asegurarse de que la sangre que se va a usar para transfundir está libre de hepatitis B y C y de VIH”.
En síntesis, las pruebas agrupadas consisten en combinar muestras de varias personas en un solo tubo y analizarlas conjuntamente mediante RT-PCR, la técnica de referencia: si los resultados del análisis son negativos, se descarta la infección de todo el grupo; si resultan positivos, cada muestra se vuelve a analizar de manera individual. Por ejemplo, en una empresa o residencia de 20 personas se sospecha que hay una infectada. Se las divide en cuatro grupos de cinco. Se detecta el grupo positivo y se analiza de forma individual: nueve pruebas en lugar de veinte.
El escenario ideal
El método es más eficaz cuando se aplica en entornos de baja prevalencia del virus, pues si está demasiado extendido el test agrupado casi siempre resultará positivo. Como señala el químico Dor Ben-Amotz, de la Universidad de Purdue en Estados Unidos, en un artículo prepublicado en medRxiv, “la agrupación óptima puede usarse en poblaciones con una probabilidad de infección muy baja, del 0,1%, utilizando un tamaño de grupo de 32 muestras”. Y añade que la relevancia práctica del sistema se ha visto respaldada por la positiva experiencia, el pasado mes, del Hospital Baptista en Memphis con bomberos, policías y funcionarios municipales, tras usar agrupaciones de 7 personas en un entorno de infección del 2,4%. Y en mayo, según se informa en Nature, funcionarios de Wuhan, en China, utilizaron este método y llegaron a unos diez millones de personas en poco más de dos semanas analizándolas en grupos de cinco.
“En escenarios por encima del 10-15% de prevalencia en la población que analizas, la eficacia de la agrupación (pooling) se reduce bastante”, concreta Federico García. El SARS-CoV-2 reúne esas características. “En esta pandemia -añade-, por la rapidez de reacción que nos ha requerido la situación y lo desconocido del virus, ha funcionado mucho el ‘boca a boca’ entre compañeros. Desde que empezamos a hablar de este sistema, me consta que varios centros ya han empezado a utilizarlo”.
Para validarlo, Federico García ha coordinado, junto con Adolfo de Salazar y otros miembros de su equipo, y Antonio Aguilera, del Complejo Hospitalario de Santiago, un ensayo nacional multicéntrico en el que han participado, además de los dos citados, los hospitales Virgen de las Nieves, de Granada, Jerez, Jaén, Reina Sofía de Córdoba, Lucus Augusti de Luego, Pontevedra, Dr. Negrín de Gran Canaria, Valme en Sevilla y Ramón y Cajal en Madrid.
“En la infección por SARS-CoV-2, los datos sobre la mejor estrategia para la detección de casos por la agrupación de muestras y cómo influye en la sensibilidad del análisis RT-PCR son limitados; por lo tanto, era necesario investigar el efecto del número de muestras, especialmente con ensayos disponibles comercialmente”, se explica en el artículo que han publicado en la plataforma medRxiv y que está en fase de evaluación en la revista Clinical Microbiology and Infection, una de las diez mejores de la especialidad.
Resultados excelentes
Entre marzo y mayo, recogieron 3.519 hisopos naso-oro-faríngeos de pacientes o profesionales de la salud y se procesaron en los laboratorios de virología de los centros participantes. Las muestras se inactivaron y trataron según la metodología de cada laboratorio. Se hicieron grupos de nueve o diez muestras, y el cribado se realizó mediante la reacción en cadena de la transcriptasa inversa-polimerasa. “Analizamos todas las muestras individualmente y también en paralelo, formando 353 grupos (342 grupos de 10 muestras y 11 grupos de 9 muestras). De las individuales, 241 (6,85%) dieron positivo. Y 253 grupos (2.519 muestras) fueron negativos (242 grupos de 10 muestras y 11 grupos de 9 muestras). Por otro lado, 99 grupos (990 muestras) fueron positivos (99 agrupaciones de 10 muestras). Un grupo de 10 muestras fue invalidado. Por lo tanto, nuestra estrategia de agrupación habría ahorrado 2.167 (86%) pruebas de PCR”.
Precisan que 323 grupos con 3.219 muestras tuvieron resultados concordantes con las muestras individuales analizadas (242 agrupaciones con 2.229 muestras negativas y 99 con 990 muestras que incluían al menos un positivo). Para 29 grupos (290 muestras) encontraron resultados discordantes con las muestras individuales: en 24 grupos había pequeñas discordancias y en 5 discordancias grandes.
Cuando solo se consideraron las principales discordancias, la sensibilidad, especificidad y los valores predictivos positivos y negativos para la agrupación fueron del 97,93%, 100%, 100% y 99,85% respectivamente. La precisión también fue del 99,86% y el coeficiente concordante de kappa de 0,988. Cuando se consideraron todas las discordancias, esas cifras fueron del 85,48%, 100%, 100% y 98,94% respectivamente. La precisión en este caso fue del 99% y el coeficiente kappa concordante de 0,916.
Los autores explican que, al igual que ocurre en otros ensayos de este tipo, la dilución de muestras en esta estrategia de agrupación condujo a una pérdida media de 2,87 Ct (Cycle threshold, umbral de ciclo, una medición relativa de la concentración del objetivo en la reacción de PCR), para el gen E, de 3,36 Ct para el gen RdRP y de 2,99 Ct para el gen N. “Esta caída en la sensibilidad fue responsable de la mayoría de las discordancias encontradas en nuestro estudio, que se observaron principalmente para muestras con la menor señal de positividad, siempre con Ct muy cercanas a 40 (en cada ciclo de PCR se mide la fluorescencia emitida y se obtiene una curva cuando se completan todos los ciclos, normalmente unos 40), y muy frecuentemente en un solo gen de los dos-tres que se incluyeron en las pruebas. Es sabido que la mayoría de los resultados positivos obtenidos de solo un gen y con Ct > 35 corresponden a partículas no viables o no infecciosas que aun así son detectadas por PCR”.
Una limitación ventajosa
Reconocen como limitación del estudio la variabilidad en la extracción y amplificación, los métodos utilizados y el número de muestras incluidas en los diferentes grupos. “Sin embargo, esta limitación en el diseño puede convertirse en su principal fortaleza dada la consideración de que incluso en este escenario nuestros resultados fueron excelentes. En la estrategia de agrupación de muestras, es una prioridad determinar el tamaño del grupo en el que se mantiene la máxima precisión en el análisis, ya que debido a la dilución puede disminuir la sensibilidad de la PCR. Además, la principal ventaja del sistema es que permite utilizar los mismos protocolos estándar de reactivos comerciales, sin necesidad de capacitación, equipo o materiales adicionales, y en consecuencia puede ser implantada de inmediato para ampliar las capacidades de detección y vigilancia del SARS-CoV-2”.
El equipo matiza que la agrupación como estrategia de detección no eliminará la necesidad de test individuales, esenciales cuando la transmisión comunitaria se intensifica. Sin embargo, en la situación epidemiológica actual, en la que la prevalencia ha ido disminuyendo pero continúa la alta demanda de pruebas de PCR, este método ayudaría a los laboratorios clínicos a aliviar la carga de trabajo a fin de prepararse para futuros brotes. “La validación de estas técnicas de pooling es posible gracias a la baja incidencia actual de la infección”, confirma Federico García. “Su uso nos va a permitir estar mejor preparados ante un rebrote y ante posibles déficits de existencias, como los de reactivos, por ejemplo, experimentados por las casas comerciales al inicio de la pandemia”.
Al jefe de Microbiología del Clínico granadino no le parecen bien los análisis generalizados como pretenden algunos países o autoridades sanitarias, preocupados por el riesgo que plantean los asintomáticos y presintomáticos: “No creo que sea útil hacer PCR de forma masiva a toda la población. Para que esta medida fuera eficaz, habría que repetir estas PCR cada cierto tiempo; no sé cada cuanto tiempo sería lo razonable, pero probablemente con bastante frecuencia. Y esto es sencillamente inviable, además de poco operativo”.
De todos modos, la estrategia que han validado, con una excelente precisión en grupos de alrededor de diez personas, permite plantearse análisis mucho más ambiciosos que los actuales y acotar los focos que vayan apareciendo. La FDA estadounidense, por ejemplo, ya ha publicado una guía que sustenta la autorización de pruebas agrupadas.
África no se queda atrás
Varios países africanos, al igual que en otros continentes, han recurrido al rastreo de contactos y a la realización de test del coronavirus en miles de personas como forma de monitorizar la pandemia y tratar de limitar las transmisiones. E incluso unos pocos, como Ghana y Ruanda, han recurrido a la estrategia de las pruebas agrupadas. Leon Mutesa, profesor de Genética en la Universidad de Ruanda, explica en The Conversation Africa, que “una ventaja de los test conjuntos es que permiten la detección de personas asintomáticas, lo que conduce a una gestión temprana y rompe la cadena de transmisión. La desventaja es que puede haber una disminución en la sensibilidad de la prueba. Por ejemplo, los pacientes con una infección reciente tienden a tener una carga viral baja, y debido a los efectos de dilución de la mezcla de muestras, existe la posibilidad de perder un caso positivo”, aunque reconoce que este riesgo existe igualmente en los test individuales de PCR.
Para sus pruebas, Mutesa ha validado un algoritmo desarrollado por su colega Wilfred Ndifon que en la segunda ronda de análisis divide las muestras en grupos superpuestos en una matriz cúbica de filas y columnas. “Nuestra investigación ha comprobado la eficacia en grupos de 20 y hasta 50 muestras conjuntas, que se pueden aplicar en trabajadores de mercados y bancos, en prisiones y en reuniones masivas”.
La agilidad de este método “ayuda a identificar nuevos puntos críticos de infección y permite una respuesta rápida de los funcionarios de salud pública”. Además, los costes, en países con recursos muy limitados, disminuyen a medida que baja la prevalencia y la tasa de transmisión. “Aunque reducir inicialmente la prevalencia es costoso -añade con optimismo Mutesa-, mantener una baja prevalencia a partir de entonces hasta eliminar el virus por completo será progresivamente más asequible”.
No son un invento de ahora, pero apenas se han aplicado frente al coronavirus. Un equipo de microbiólogos españoles ha confirmado el enorme ahorro de tiempo y dinero que suponen. Off José R. Zárate Análisis Clínicos y Bioquímica Clínica Offvia Noticias de diariomedico.... https://ift.tt/32eVx4h
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