Tras revolucionar los laboratorios de bioingeniería de todo el mundo, la herramienta de edición genética CRISPR/Cas9 ya tiene un Premio Nobel (Química de 2020, a las científicas Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier). Mientras, la terapia celular con linfocitos CAR-T ha llevado la esperanza a muchas personas afectadas por enfermedades hematológicas que antes de su llegada no tenían ninguna opción terapéutica.
La alianza es beneficiosa por partida doble. Por un lado, la tecnología CRISPR puede ayudar a optimizar a los linfocitos T autólogos con CAR que, si bien obtienen muy buenos resultados en ciertos cánceres de sangre, no son eficaces en todos los pacientes. Por otro lado, la preparación ex vivo de los linfocitos permite ensayar este corte genético sin los riesgos que plantea, por el momento, su uso directamente en el enfermo.
Así parece reflejarlo la plataforma internacional de ensayos Clinicaltrials.gov, donde, de los más de 40 estudios clínicos con tecnología CRISPR registrados, casi la mitad utilizan esta herramienta para editar de alguna forma a los linfocitos T como tratamiento en diversos tipos de cáncer. La modificación de las células T mediante la edición del genoma se ha explotado con varios propósitos en el campo de la terapia celular adoptiva.
El objetivo es conseguir –mediante la supresión de genes– una nueva generación de células CAR-T más potentes o bien productos universales, evitando así la enfermedad de injerto contra receptor y dando el salto al uso off-the-shelf: células listas para administrar en cualquier paciente. “La alta eficiencia de la edición de genes y la flexibilidad general del sistema CRISPR/Cas9 lo convierten en la herramienta más relevante para editar con precisión y rapidez un gran número de células T que se utilizarán en terapia celular adoptiva”, se expone en una revisión reciente en Frontiers in Immunology realizada por investigadores del Hospital Universitario de San Rafael, en Milán.
Entre los enfoques actuales para mejorar la terapia CAR-T , destacan los dirigidos a modificar algunas moléculas que les frenan para evitar su sobreactuación y garantizar la seguridad. Es el caso de la proteína 1 de muerte celular programada (PD-1) y su ligando PD-L1, apunta Sandra Rodríguez, jefa de la Unidad de Citogenética Molecular del Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO). El equipo de esta científica investiga en aplicar la técnica CRISPR para destruir las células tumorales eliminando sus genes de fusión. Según explica de forma sencilla sobre el eje PD-1/PD-L1, “el tumor puede aprovechar esos frenos para esconderse de la célula inmune. De ahí que al eliminarlos de la célula T, se logre una célula más eficiente”. Si, además, se elimina la expresión del receptor endógeno de las células T (TCR), se evita la potencial competencia entre este y el receptor transgénico CAR. “Al borrar los rasgos propios del linfocito T, los elementos introducidos están representados al máximo, de forma que se logra una célula CAR-T más específica a la hora de dirigirse al tumor”. Esta es la estrategia planteada por el grupo de Carl June, de la Universidad de Pensilvania, y publicada en Science, con la que realizaron tres cortes concretos en los linfocitos T: los genes que codifican PD-1 y las cadenas alfa y beta del TCR. Los linfocitos T modificados con CRISPR se emplearon en tres pacientes que tenían cáncer metastásico refractario (uno de ellos había recibido ocho líneas previas de quimioterapia y tres, trasplantes de médula ósea), y se obtuvo respuesta en dos.
Raúl Torres, investigador en la Unidad de Citogenética Molecular, destaca que, “además de aumentar la especificidad, se consigue hacer crecer la vida media de los linfocitos”. Torres recuerda que, en concreto, en este estudio se recuperaron linfocitos en la sangre de los pacientes meses después de haberlos introducido.
Siguiendo esa línea de investigación, en el último congreso de la Sociedad Americana de Hematología (ASH), Marco Ruell, del grupo de Pensilvania, presentó resultados de un experimento en el que eliminaron con CRISPR/Cas9 el gen CD5 –codificador de la proteína homónima de la superficie de los linfocitos T, y una de las moléculas que puede inhibir su activación– de las células CAR-T. Las células resultantes exhibieron una mayor proliferación en sangre periférica y una mayor reducción del tamaño del tumor, así como más supervivencia en modelo experimental de leucemia y linfoma. Esta vez los resultados se obtuvieron con ratones, pero este equipo espera iniciar pronto un ensayo clínico en esta dirección.
Otra posibilidad que se indaga, esta vez de la mano del grupo de Michel Sadelain en el Centro del Cáncer Memorial Sloan Kettering, en Nueva York, consiste en servirse de la precisión de CRISPR para insertar el CAR en el lugar deseado. Al mismo tiempo que CRISPR corta genes específicos del linfocito, se puede administrar un fragmento de ADN que tenga homología con la secuencia cortada e insertarla en esa posición. Con esa premisa, estos investigadores eliminaron el gen del receptor endógeno de las células T crispy en ese sitio situaron el CAR, mediante un virus adeno-asociado que no se integra (aunque podría hacerse mediante otro vector, como un plásmido). De esta forma, se consigue que todas las células T expresen el CAR bajo el promotor del TCR. Es una inserción dirigida del CAR, un concepto que, quizá, seguirá desarrollándose en los próximos años.
Sin duda, una aplicación de la edición genética con CRISPR que podría dar un vuelco al campo sería poder fabricar células CAR-T alogénicas. “A menudo los pacientes que van a recibir terapia CAR-T han sido tratados y tienen poca cantidad de linfocitos T o estos son de baja calidad, por lo que no pueden utilizarse para producir células CAR-T a partir de ellos. Una posible solución es utilizar linfocitos T de un donante sano. El problema de utilizar esos linfocitos es que podrían reconocer los tejidos del paciente como extraños y atacarlos (reacciones de injerto contra receptor); para evitar esto es necesario inhibir el TCR de los linfocitos T que infundes, ya que el reconocimiento de los antígenos se hace a través de este receptor. Una de las técnicas para eliminar el TCR es, efectivamente, editar su expresión génica con CRISPR”, comenta Lucía Fernández, de la Unidad de Investigación Clínica de Tumores Hematológicos H12O-CNIO.
Esta investigadora apunta otra posibilidad en la que están trabajando: “Utilizar otra fuente de células inmunes con capacidad citotóxica que no sean alorreactivas, es decir, que sin capacidad de reconocer como extraños los tejidos del receptor, como pueden ser las NK o el uso de linfocitos T de memoria (CD45RA-), como hacemos en el laboratorio, o linfocitos T específicos de virus”.
La estrategia, además de facilitar el acceso de la terapia a más pacientes, topa con algunas peculiaridades. “En la terapia alogénica, una vez recuperada la inmunidad del receptor, lo más probable es que los linfocitos T alogénicos se “pierdan”, porque los linfocitos T autólogos los reconocerán como extraños. Las NK también han mostrado poca capacidad de expandirse in vivo una vez infundidas. Este agotamiento puede ser perjudicial si ocurre demasiado rápido y no da tiempo a eliminar el tumor, pero por otro lado, puede ser beneficioso por el hecho de que puede evitar toxicidad. En caso de que la terapia CAR-T o CAR NK se agote demasiado rápido, la posible solución pasaría por hacer infusiones periódicas de la terapia celular”, considera Fernández.
Para que CRISPR llegue a la clínica, de una u otra forma, habrá que acreditar la seguridad. A pesar de su alta precisión, esta técnica no está exenta de generar cortes inespecíficos que pueden conducir a la activación de genes promotores de cáncer o, al contrario, eliminar genes que lo suprimen. Como recuerda Rodríguez, “con el lentivirus [el vector que se utiliza para insertar el CAR en la célula] no se ha visto en ningún linfocito T que haya habido una integración inadecuada. Pero con el CRISPR haces cortes y puede que aparezca alguno off target. Todavía hay que andar el camino de la seguridad antes de que se extienda este uso en la clínica”.
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